气相色谱法检测药物中有机残留溶剂

       药品中的残留溶剂是指在合成原料、辅料或制剂生产过程中使用或产生的挥发性有机化学物质。他们在生产过程中未能被全部清除,服用后对人体有毒性和致癌作用,近年来日益引起各方面的重视,在新药研究中要求越来越严格。我国在1995年药典也规定7种限制溶剂残留项,在2000年药典中,根据ICH的限度要求对这7种溶剂残留进行调整。ICH要求检测的溶剂就有69种,虽然我国药典并未要求按ICH的规定实施,但在新药研究中对于残留溶剂的要求事实上是参照ICH的规定执行的。这是SDA对新药研究从严从高要求的体现,也是与国际接轨,适应WTO规则的需要。在实际工作中,药品的合成、制剂、消毒工作涉及到的有机溶剂有上百种,(气相色谱仪)气相色谱法是中国药典对有机残留溶剂测定的法定检测方法,也是检测有机溶剂的、的方法之一.

　　1、(气相色谱仪)气相色谱法

　　1.1样品的处理

　　一般是将样品溶于适当的溶剂中,能达到的浓度越高越好,以利于残留量极微溶剂的测定。由于样品复杂多样,为提高样品浓度,所用溶剂也是多种多样。一般常用溶剂为水、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO),也有用四氯化碳4、二甲基乙酰胺、乙醇5、正己烷、二氧六环、乙酸、甲氧基乙醇6、氢氧化钠溶液7、十二烷基磺酸钠溶液8等的,不一而足。大部分为单独使用,也有的混合使用,主要目的就是增加样品溶解度。所用溶剂与所测溶剂应达到较好的分离。其中二甲基甲酰胺、二甲亚砜因其溶解范围广,溶解性好,素有“能溶剂”之称,是的溶剂。需要注意的是,样品一定要溶清,保证所测组分都溶解在溶剂中。在一段时间里,曾将不溶性样品用水等溶剂超声提取、离心,取上清液进样,后来发现这样不能提取,影响测定结果,不尽合理。所以在后来的新药报批中均要求将样品溶清后进样,这在溶剂残留测定中是一大发现和进步。直接进样的样品取一定量溶液进样测定即可,顶空进料的样品需要在进样前保温一定时间,使气液或气固两相达到分配平衡,然后再进行测定。

　　对于液体样品来说,可以将对照品定量加入到样品中制成对照品溶液,与样品溶液同时进样,要求样品溶液的残留溶剂峰面积的两倍不得超过对照峰面积。蒋海松、关大卫用此法测定壬苯醇醚中二恶烷的残留量11,何培孝、樊庆银测定壬苯醇醚中二氧六环的12,结果与部颁标准一致,相比而言方法更加简便、准确、可靠。有的样品需要经过萃取、吹扫-捕集等富集,浓缩方法处理,使待测组分达到一定的浓度后再进样测定,可以使结果更准确,一般用于微量残留溶剂或限度要求较高的溶剂如苯的测定。蔡春、关景华用吹扫-捕集方法13,测定硬膏剂中甲苯残留量。具有自动化程度高,回收率好等优点。陈晓莉在吉非罗齐中残留醚化物及其它杂质的定量分析中,先将样品溶解于氢氧化钠溶液中,再用正己烷提取,取得满意的结果14。

　　1.2定量方法

　　用色谱峰定量的标准技术分为四种15,分别为面积归一化法、标准物添加法、外标法、内标法。前两种方法很少见到,一般用后两种方法。中国药典2000年版规定两种方法均可,美国药典24版(US2PXXIV)16、英国药典2000年版(BP2000)17均要求用外标法。内标法不要求所有组分都分离、流出和检测出来。它只需将要分析的峰与内标物分离即可。内标物必须符合下列要求:在样品中原来没有内标物的存在;内标物必须与所有样品组分分离;内标物的流出时间应尽量接近待分析组分;内标物应与待分离的物质具有相近的浓度、物化特性和检测器的响应值;内标物必需稳定、不起化学反应、纯度高、挥发性应很低以允许长期保存并且在注样过程中损失小。待测样品可以是一个或一个以上。本方法可以消除仪器与操作造成的误差。外标法是用待测组分的峰面积和峰高与一系列已知的(或外加的)标准样相比较。标准浓度与待测组分浓度的浓度量级应相同。样品与标准品进样浓度与色谱条件应完致,标准曲线的浓度范围应包括全部样品中待测溶剂的浓度。标准曲线应由同样体积的标准物作出。一般适用于进样重复性较好的样品。

　　1.3进样方式

　　气相色谱法的进样方式一般分顶空进样和直接进样两种。顶空进样又分为溶液顶空和固体顶空。前者就是将样品溶解于适当溶剂中,置顶空瓶中保温一定时间,使残留溶剂在两相中达到气液平衡,定量取气体进样测定。固体顶空就是直接将固体样品置顶空瓶中,置一定温度下保温一定时间,使残留溶剂在两相中达到气固平衡,定量取气体进样测定。在文献报道中,溶液顶空应用较多,而固体顶空应用较少。一般进样体积2mL以下。近年来顶空进样法的应用越来越多,其优点是可以使残留溶剂气化后进样,浓度与溶液相比有很大增加。进样室在较低温度下操作,可避免组分分解。顶空进样也可大大减少溶解样品的溶剂和样品本身对色谱系统带来的干扰和污染,缩短分析时间,增加柱子寿命,而且提高样品的重现性18。但是顶空进样只对那些蒸汽压足够高以至他们在顶空中的浓度大到足以使检测器有响应的物质才能产生色谱峰。加大进样量虽可以增加较不挥发物质的量,但会带来峰变宽或重叠、分离度变差等问题,所以一般只应用于沸点100℃以下的低沸点溶剂19。另外,一般顶空进样都需要采用自动的顶空进样器,费用昂贵,成本较高。董英、战祥友自制顶空装置20,顶空法测定胆红素中乙醇和氯仿的残留量,孟德贤、郭向勇用自制的顶空瓶测定合成药佐匹克隆中的残留溶剂21,测定结果满意,可以借鉴。吕志华等分别用溶液顶空和固体顶空的方法比较22,测定几丁糖酯中的乙醇、丙酮的溶剂残留量,两种方法测定结果一致,经显著性检验无显著差别。在本试验中顶空进样法检测限低,精密度高,主要是因为以水为溶剂进行的顶空进样受平衡温度波动的影响较大。王伟、韩光智用气固顶空法测定伊索拉啶中乙醇的残留量,方法可靠准确23。固体顶空不受样品溶解度影响,适合蒸汽压高、沸点低、含量低的残留溶剂且不易溶解的样品。在用毛细管柱时,一般又选择分流法进样。分流法是指在气化室出口分两路,绝大部分放空,极小部分进柱子。这两部分比例叫分流比。又分为动态进样和静态进样,一般应用较多的是动态进样24。溶液直接进样是指将样品定量溶解于适当溶剂中,准确量取适量注入气相色谱仪测定溶剂残留量的进样方法。进样体积一般为2μL以下。本法为通常采用的方法,适用于受热不易分解的样品,约占发表文章总数的四分之三。溶液直接进样的方法进样量大,可以弥补检测器灵敏度的不足,操作也简便易行。大的缺点是污染进样口和色谱柱,需要及时清洗。另外由于进样量大,除溶剂峰响应值大,分析时间较长外,还有各种分解产物和溶剂杂质峰干扰测定。一般需选用程序升温快速除去溶剂并选用纯度较高的溶剂。但在毛细管柱的应用中,本方法的长期使用有可能堵塞毛细管柱口而使色谱柱无法正常使用。

　　1.4色谱柱的选择

　　气相色谱柱是样品中残留溶剂测定的理论与物质基础,所以对色谱柱的选择也是关键的步骤。气相色谱柱可分为填充柱和毛细管柱两大类,其中填充柱又分玻璃柱和不锈钢柱;毛细管柱按柱__口直径一般又有0153mm和0132mm两种规格,前者又叫大口径毛细管柱,柱容量大,在残留溶剂测定中应用较多。由于毛细管柱造价高,中国药典2000年版结合中国国情,用填充柱测定,美国药典24版(USPXXIV)和英国药典2000年版(BP2000)要求用毛细管柱。从填料来分,填充柱一般选用高分子多孔小球系列(GDX101,GDX102,GDX103,GDX301,GDX401)直接测定。GDX的表面积大(1～500m2/g),有一定的机械强度,可在250℃以下应用。无论极性还是非极性物质,在这种固定相上的拖尾现象都降到限度;它和羟基的化合物亲和力极小,可使水、醇类物质大大提前流出柱子;氧化氮、HCN、NH3、SO2、COS等活泼气体可以很快流出,不干扰测定,这些优点对残留溶剂测定来说是比较理想的。这类填料的应用约占填充柱测定残留溶剂的文献的90%。GDX既是性能优良的吸附剂,能直接作为气相色谱的固定相,直接用于气固分析,也能作为担体涂布PEG系(PEG20M,PEG2M,PEG10000,PGE5000),DEGS(丁二酸二乙二醇酯),DG(缩二甘油),丙二醇乙二酸聚酯,OV-225,SE52(苯基甲基硅酮)等固定液,用于残留溶剂测定,当然担体的选择也有多种,如6201、硅藻土、PoraparkQ等。在柱子的选择上,一般选用GDX系列就能解决问题,但对于某些样品,就需要用某些固定液来进行分离才能满足要求,如二甲基甲酰胺26。选择原则是相似相溶,对于醇、胺等能形成氢键的物质,除上面介绍的GDX外,也可选择极性固定液。另外也可将不同极性的固定液混合涂布在担体上进行分离27。

　　毛细管柱的种类也很多,如OV-101,SE-54,CP-Sil-5CB28,AC-20,SE-30,HP-5,HP-20M,100%二甲基硅氧烷,AT-624,TFAP等,一般长10～30m不等。填充柱价格便宜,易得,一直占据溶剂残留量检测的主导地位,只是柱效较低,只有500～1000左右,分离复杂样品的能力差。杨绍英、陈志华在测定心痛定中两种残留溶剂时就分别用两种色谱条件,比较麻烦29。但填充柱仍然是我们的首要选择。张咏梅、洪铮在紫杉醇原料药中有机溶剂残留量的气相色谱分析中,应用GDX401填充柱同时检测甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷,方法准确可靠30。王卫、高立勤在测定盐酸莫索尼定有机溶剂残留量时以正丙醇为内标,用GDX-401填充柱测定乙醚和异丙醇的残留量,方法灵敏、准确、可信31。邓湘昱也用GDX-401填充柱测定盐酸土霉素中残留甲醇,结果证明方法简单可靠32。黄剑英、顾以振用GDX-401填充柱、用恒温条件建立同时测定中国药典规定的7种溶剂的测定方法,方法分离度较好,准确可靠33。这些均说明填充柱在测定残留溶剂中的重要作用。近年来,毛细管柱应用越来越多,有取而代之的趋势。特别是近两年,文献报道关于残留溶剂测定的文章中,用毛细管柱测定的约占总数的90%,填充柱只占10%,由此可见其趋势。毛细管柱的理论塔板数约为10万左右,与填充柱相比柱效和灵敏度均要高的多,对复杂和微量残留溶剂的分析能力有极大的提高,所以选择毛细管柱一般都能解决分离问题。其中柱口直径为0153mm的大口径毛细管柱因其柱容量大尤其应用广泛。姚倩、李章万、张强等用几种大口径毛细管柱,以药物合成中常用的16种有机溶剂为研究对象,建立检查残留溶剂的方法,并考察不同极性的色谱柱(HP-1,HP-5,HP-20M)及不同提取溶剂(水,DMF,DMSO)对分离与检测的影响。在雌激素原料残留溶剂的检测中,除甲醇和乙醇外,其它14种溶剂均在检出限度以下,方法简便灵敏,准确度高,说明本方法适用于常规药物中溶剂的检查。另外应用毛细管柱的例子还有很多,不胜枚举。

　　1.5柱温的选择

　　柱温对分离起关键作用,视所测组分和所选用色谱柱而定,一般用固定温度分析,即恒温色谱(IGC),柱温范围在50～200℃左右,根据样品与残留溶剂的分离情况而定。对于沸程很宽、残留溶剂种类较多的样品可选用程序升温的办法(PTGC)。

　　1.6检测器的选择

　　一般选用FID检测器,也有选用MS为检测器的,多为GC-MS联用仪。对于含氯元素的溶剂,选用ECD检测器专属性强,可排除杂质干扰。中国药典2000年版、美国药典24版(USPXXIV)均选用FID检测器,英国药典2000年版(BP2000)则上述三种检测器均有应用。